Analytische Trennmethoden PDF

Die zweidimensionale Gelelektrophorese oder 2D-Gelelektrophorese ist eine analytische Methode in Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik. Da sich Proteinmuster in biologischen Systemen umwelt- und zustandsabhängig verändern, können sie zur Unterscheidung geschädigter und gesunder oder auch optimal und suboptimal gewachsener Zellen herangezogen werden. Die Gewinnung analytische Trennmethoden PDF Verarbeitung der Probe erfolgt unter möglichst identischen Bedingungen.


Författare: Georg Schwedt.

Damit wird ausgeschlossen, dass neben den zu untersuchenden experimentellen Variablen verfälschende Einflüsse auf die Probe einwirken. Proteinextrakt in einem pH-Gradienten-Gel im elektrischen Feld eindimensional aufgetrennt. Damit sind sie für die Wirkung des elektrischen Feldes auf die Proteine verantwortlich. Der Gelstreifen besteht aus einer Polyacrylamidmatrix. In diese Matrix werden sogenannte Immobiline einpolymerisiert. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes formen sie einen pH-Gradienten, der allerdings zeitinstabil ist.

Mit zunehmender Zeit wandern die den Gradienten definierenden Ladungsträger zu den Gelenden und verformen über kurz oder lang dessen Verlauf. Weiterhin kann als erste Dimension alternativ eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einem kationischen Detergens wie 16-BAC durchgeführt werden. Dies dient der Beseitigung von Disulfidbrücken. Der Gelstreifen mit den nach dem pH-Wert aufgetrennten und äquilibrierten Proteinen wird bei vertikalen Systemen auf die Kante eines quadratischen bzw. Bei horizontalen Systemen wird der Gelstreifen dagegen einige Millimeter vom Gelrand entfernt auf das flache SDS-Gel gelegt.

Besonders um mehrere Proben auf einem 2D Gel zu trennen, werden kovalent bindende Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Dazu werden maximal drei verschiedene Proteinextrakte mit je einem Farbstoff markiert, gemischt und gemeinsam auf demselben Gel getrennt. Die klassischen Proteinfärbungen erfolgen nach der elektrophoretischen Trennung. Durch die zweidimensionale Gelelektrophorese lassen sich in bakteriellen Extrakten nach Färbung der Proteine oft weit über tausend verschiedene Proteinspezies nachweisen.

In Mausembryonen ließen sich circa 10. Beim Digitalisieren von 2D-Gelen werden die 2D-Muster in Pixel mit verschiedenen Grauwerten zerlegt. Die Auflösung bestimmt die Genauigkeit in x- und y-Richtung, die Farbtiefe die Menge der Graustufen, welche für die Abbildung der Proteinmenge pro Pixel zur Verfügung steht. Durchlichtscans mit einer OD bis 4. Ohne eine entsprechende Kalibrierung der Proteinkonzentrationen, Farbstoffsignale und Grauwerte sind quantitative Aussagen jedoch später nur bedingt möglich.

Ebenfalls verfügbar für das Digitalisieren der Gele mit sichtbaren Farbstoffen sind inzwischen kamerabasierte Systeme. Zur Detektion von Fluoreszenzfarbstoffen werden hauptsächlich lichtstarke Laserscanner genutzt, bei denen die Wellenlänge des Anregungslichtes und die Filteroptik für das Abstrahlungslicht der Fluoreszenzfarbstoffe flexibel angepasst werden können. Auch hier werden die etablierten Systeme inzwischen durch kamerabasierte Geräte komplementiert. Für den Nachweis von radioaktiven Isotopen, welche in die Proteine eingebaut worden sind, werden sogenannte Phosphorimager eingesetzt.

Hier wird eine sogenannte Imaging-Platte dem getrockneten 2D-Gel für mehrere Stunden ausgesetzt. Die freiwerdende radioaktive Strahlung wird in der Imaging-Platte gespeichert und vom Phosphorimager ausgelesen. Systeme zur Detektion der Eigenfluoreszenz von Proteinen unter UV-Licht durch Anregung aromatischer Aminosäuren wie Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan konnten sich bisher nicht durchsetzen, versprechen aber eine interessante Alternative, da keine teuren Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen. Bei den Single Channel Techniken wird in der Regel eine Serie von Gelen aufgenommen, die vollständig auf die gleiche Art und Weise eingefärbt wurde.

Beim Gel-Multiplexing werden von ein und demselben Gel mehrere Bilder unabhängig voneinander generiert. Verschiedene Farbstoffe oder Labels werden eingesetzt, die verschiedene Eigenschaften der getrennten Proteine darstellen. Beispielsweise können die Proteinmenge durch den Flamingofarbstoff und die Proteinphosphorylierung durch den ProQ-Diamond Farbstoff im selben Gel detektiert werden. Beide Fluoreszenzfarbstoffe werden separat vom Scanner detektiert und in zwei Graustufenbildern gespeichert. Im dargestellten Falschfarbenbild sind in rot die neu synthetisierten und in grün die akkumulierten Proteine sichtbar. Farbkanälen kann gleichzeitig Phosphorylierung und Glykosylierung von Proteinen detektieren. Alternativ zur unabhängigen Detektion von verschiedenen Proteineigenschaften über verschieden spezifische Farbstoffe bzw.

Labels können bei der DIGE bis zu drei Proben gleichzeitig auf einem Gel detektiert werden. Dazu werden die Proteine der drei Proben separat vor dem elektrophoretischen Lauf kovalent mit den Cyanin-Farbstoffen Cy2, Cy3 und Cy5 verknüpft. Klassischerweise werden 2D-Gele visuell am Licht- oder bei Fluoreszenzfarbstoffen am UV-Tisch ausgewertet. Aufgrund der Komplexität von Proteinmustern führt eine softwaregestützte Analyse zu verlässlicheren Ergebnissen. In moderner Analysesoftware wird vom Originalbild Background und Artefaktbild abgezogen.

Um Gelbilder quantitativ zu analysieren, sollten sie vom 2D-Gel-typischen inhomogenen Hintergrund befreit und von artifiziellen Signalen bereinigt werden. Das nebenstehende Bild zeigt beispielsweise die Zerlegung eines Gelbildes in eine Hintergrundkomponente, eine Komponente mit artifiziellen Signalen und die für die weiterführende quantitative Analyse genutzte Spot-Komponente. Ein lange Zeit ungelöstes Problem stellte die schwierige positionelle Reproduzierbarkeit der Proteinmuster im 2D Gel dar. Eine mögliche Lösung bestand in der Vermeidung unabhängig hergestellter Gele. Die DIGE mit der simultanen Trennung von bis zu drei Proben pro Gel ist ein gangbarer Weg, wird allerdings bei mehr als drei Proben wieder mit dem Reproduzierbarkeitsproblem konfrontiert, da dann wiederum mehrere Gele miteinander verglichen werden müssen. Da es bis heute keine befriedigende experimentelle Lösung zur Vermeidung von Laufunterschieden gibt, musste auf Ebene der Softwareanalytik eine Lösung gefunden werden.

Beim Spot Pattern Matching wird mit Hilfe einer Software im rohen 2D-Gelbild im ersten Schritt nach Proteinspots gesucht. Schwächen bei der Spotdetektion führen jedoch zu Spotzuordnungsfehlern bei diesen Verfahren. Jahr 2000 in die 2D-Gel-Analyse eingeführt. Automatische Verfahren des Image Warpings nutzen die gesamte in den 2D-Gel-Bildern vorhandene Pixel-Information für die Berechnung einer Bildtransformation, die zur bestmöglichen positionellen Übereinstimmung der zu vergleichenden Gelbilder führt.